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论文解读--尼罗罗非鱼MyD88 基因荧光定量PCR检测方

作者:365体育官网更新时间:2019-11-06 23:12点击次数:字号:T|T

  髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)是天然免疫反应中一类重要模式识别受体-Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)信号通路中的接头蛋白,是信号向下游传导的关键靶分子。MyD88现已在多个物种中分离鉴定出来,并检测到其在心、肝、肾、脾、肌肉和血液等组织中普遍表达,MyD88有着重要的生物学功能。实验研究选择实时荧光定量PCR技术作为试验的技术途径,以β-actin基因为内参,建立尼罗罗非鱼MyD88荧光实时定量检测平台。

  实时定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、简便快速、安全可靠等优点,已被广泛应用于动物医学病理和分子生物学研究领域。在实时定量反应中,起关键作用的是能够散发荧光的探针或染料,它能与dsDNA结合,通过信号收集可以实时展现定量扩增情况。所用荧光染料SYBRGreenⅠ是一种结合于DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料,可应用于任何反应体系,方法简便且经济实惠。由于它可以和任何DNA双链分子结合,因此反应完成后必须进行熔解曲线的测定,以判定是否有非特异性产物和引物二聚体,并据此对引物及反应体系进行优化。

  经紫外分光光度计检测,RNA样品A260/A280值均在1.98~2.0之间。琼脂糖凝胶电泳结果显示(图1),5S、18S和28S带型完整,说明样品没有发生降解,质量良好,能满足后续实验操作的要求。

  目的基因MyD88和内参基因β-actin的定量扩增曲线所示,均呈典型的S型,模板浓度越高,CT值越小,随着扩增循环数的增加,荧光信号逐渐增强,当循环数达到一定程度时,荧光强度达到平台;MyD88和β-actin基因标准曲线,均在有效线性范围区间。

  熔解曲线和β-actin的熔解曲线℃处形成单一的特异峰,熔解温度均一,且峰位于5℃范围内,无特异性荧光,PCR反应产物纯度好。

  从扩增数据结果(表2)来看,除肌肉组织MyD88表达量极低外(CT值35),实验中测定的MyD88和β-actin荧光定量PCR反应CT值范围均在15~30之间,且数值集中;平均CT标准差小于0.27,变异系数小于1.0%,标准差和变异系数都较小。通过组织定量分析结果来看,健康尼罗罗非鱼体内MyD88在肝脏和脾脏中表达量最高,在血液中次之,在肌肉中表达量最低。

  R2分别为0.998和0.995,表明标准曲线线性度好,误差小;E分别为-3.320和-3.404,在较好的范围区间,大大降低了由于扩增效率过低而高估各组织MyD88相对差异的影响。MyD88和β-actin基因标准曲线,可认为其扩增效率基本一致,满足应用2ΔΔCt进行相对定量分析尼罗罗非鱼MyD88表达的条件。

  据Pfaffl报道,当实时荧光定量PCR扩增CT值变异系数小于2.5%时,定量反应结果可靠。在尼罗罗非鱼组织相对定量PCR检测中,MyD88和β-actin荧光定量PCR反应平均CT值变异系数小于1.0%,表明所建立的实时检测MyD88基因在不同组织中的表达重复性好。

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